大戰綠妖之後,蜘蛛俠帕克(托比'馬奎爾 Tobey Maguire 飾)忍痛拒絕了他唯一的摯愛瑪麗(克爾斯滕'鄧斯特 Kirsten Dunst 飾),因為蜘蛛俠的身份會為自己和親人帶來巨大危險,帕克決定獨立承擔起蜘蛛俠的責任。
帕克一直在忙於應付各種挑戰:學習超能力的靈活運用;在超級英雄與平凡大學生的雙重身份下隱藏自我、小心翼翼地生活等等。帕克對瑪麗越來越難以自拔,但是作為蜘蛛俠又不能對瑪麗展開心扉。
好友哈利因為誤會蜘蛛俠而一直處處與其為作對;唯一的親人嬸嬸也對蜘蛛俠的真實身份產生了懷疑。同時,新的挑戰又出現了:邪惡而強大的章魚博士。帕克在種種壓力下肩負起蜘蛛俠的使命。